实验原理

一、方法

1. 引物

实时 PCR 的引物必须具有基因的特异性，并能进行较短片段的扩增。

a.LUX 引物设计软件（LuxDsigner) 缺省的参数已经被设定为可以扩增 75~200bp 长度的片段，引物退火温度范围为 60~68°C, 在设置 PCR 程序时，退火溫度为 55~64°C 比较合适。该软件设置的参数可以使引物自身互补或引物间形成二聚体的可能降到最低。运用该软件进行引物设计，非常灵活，设计的引物可以橫跨外显子之间的边缘区域或结合区域。

b. 通常 PCR 反应时，引物浓度都是过量的。用 LUX 引物进行反应时，建议引物浓度用 200nmol/L。引物浓度在 50?500nmol/L 之间时，一般会得, 到理想的结果。特别是针对看家基因进行多元扩增时，建议用有限的引物浓度，这样会得到理想的结果。

2. 模板

实时 PCR 的模板可以是单链或双链的 DNA, 或 cDNA, 也可用环状 DNA(如质粒）。模板浓度通常用 10~10⁷ 拷贝或 1pg~10ug。

a. 进行实时 PCR 时，若模板是总 RNA 或 mRNA, 浓度通常用1pg~100ng。

b.RNA 的纯度和完整性对结果有直接影响。

c.RNA 酶和基因组 DNA 污染是最常见的问题，对 RNA 纯化时要注意这些问题。

d.RNA 酶的存在将会降解 RNA 模板，导致低估目的基因的表达丰度，而 DNA 的污染则相反。

e. 用横跨外显子之间结合区域的序列设计引物可以避免 DNA 污染的影响。但这种策略并不都有效，建议在对 RNA 进行纯化时加入 DNaseI。

3.Mg²⁺和 dNTP 的浓度

a.1~10 mmol/L 的 Mg²⁺浓度在一定的目的基因和引物浓度前提下可获得理想的结果，建议通常使用 3 mmol/L。逬行多元反应时，把 Mg²⁺浓度提高到 5 mmol/L。

b. 理想的 dNTP(dATP/dCTP/dGTP/dTTP) 浓度是 200umol/L。若 dUTP 替代 dTTP，dUTP 的浓度应增加到 400umol/L。进行多元反应时，把 dNTP 浓度提高到

400umol/L。

4. 酶

建议使用热启动酶。

a. 除了模板和引物，公司提供的 PCR 反应混合物非常方便。对实时 PCR 来说，建议使用 PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG(Invitrogen，11720-025，500Reactions);一步法 RT-PCR 时，建议使用 ThermoScriptOne~Step-System(Invitrogen，11731-023，500Reactions)

b. 进行多元反应时，为了避免 PCR 效率降低，50ul 反应体系中可以加 3U 的酶。

5. 仪器设备

许多专门的设备都可进行实时 PCR, 参照用户指导手册进行。下面，针对 ABIPRISM7700 型号系列检测系统的使用方法进行简要的介绍。

试剂/试剂盒

LUX引物 单链或双链的 DNA 或 cDNA Mg2+ dNTP 热启动酶

仪器/耗材

PCR 仪

实验步骤

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