cDNA 合成实验
实验原理
1. 缓冲液、溶液和试剂
0.1mol/L 二硫苏糖醇
dNTP(每种 2.5 mmol/L)
随机引物(20~40U/ml)(1034731,RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)
来自方案 4 的 RNA 样品
RNasin(Promega)
5X 反转录缓冲液
主要反应组分混合物(X 样品管数)
5X 反转录缓冲液 10ul
dNTP(2.5 mmol) 5ul
0.lmol/L 二硫苏糖醇 4ul
随机引物 4ul
RNasin 1ul
Superscript0(18064-014,Invitrogen,Carlsbad*CA)试剂储存于-20°C
2. 特殊设备
PCR 管子,0.2 ml
热循环仪(比如,AppliedBiosystems7700sequencedetector;PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)
二、方法
1. 每管加入 24ul 反应混合物。
2. 加入 25ul 方案 4 得到的 RNA。
3.70°C 变性 5 min,冰浴 5 min。
4. 加入 lulSuperscriptII(最终反应体积 50ul)。
5.37°C、60 min 孵育,90°C 变性 5 min,冰浴 5 min。
6. 使用前,cDNA 样品应当储存于-20°C。
实验步骤
1. 缓冲液、溶液和试剂
0.1mol/L 二硫苏糖醇
dNTP(每种 2.5 mmol/L)
随机引物(20~40U/ml)(1034731,RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)
来自方案 4 的 RNA 样品
RNasin(Promega)
5X 反转录缓冲液
主要反应组分混合物(X 样品管数)
5X 反转录缓冲液 10ul
dNTP(2.5 mmol) 5ul
0.lmol/L 二硫苏糖醇 4ul
随机引物 4ul
RNasin 1ul
Superscript0(18064-014,Invitrogen,Carlsbad*CA)试剂储存于-20°C
2. 特殊设备
PCR 管子,0.2 ml
热循环仪(比如,AppliedBiosystems7700sequencedetector;PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)
二、方法
1. 每管加入 24ul 反应混合物。
2. 加入 25ul 方案 4 得到的 RNA。
3.70°C 变性 5 min,冰浴 5 min。
4. 加入 lulSuperscriptII(最终反应体积 50ul)。
5.37°C、60 min 孵育,90°C 变性 5 min,冰浴 5 min。
6. 使用前,cDNA 样品应当储存于-20°C。