脱氧核酶实验_实验⽅法

实验原理

随着体外分子实验技术的发展，近年来相继发现了许多具有不同催化功能的 DNA 分子，这些被称为脱氧核酶的催化型 DNA 分子可以催化切割反应、连接反应、卟啉环金属化等许多化学反应，而且还具有 DNA 激酶活性。

实验步骤

一、材料与设备

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。

2. 放射自显影用具。

3. 水浴。

4. 脱氧核酶 ( 修饰或未修饰）由化学合成获得。

5. 脱氧核酶体外切割的底物 RNA 由体外转录获得。

6. 2X 脱氧核酶切割缓冲液：50 mmol/L Tris ( pH 7.5)，10 mmol/L MgCl₂，150 mmol/L NaCl，0.01% SDS。

7. 终止缓冲液：95% 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青，10 mmol/L EDTA。

8. 脂质体。

二、操作方法

1. “10-23” 型脱氧核酶的设计

(1) 采用 RNA 二级结构分析软件对靶 RNA 进行二级结构模拟分析，选择主环、单链凸出区作为首选切割位点。虽然目前使用的二级结构预测软件的准确性还有待于提高，但是其预测结果仍可以作为选择靶位点和设计脱氧核酶的参考。

(2) 选择切割反应发生在 RNA 分子的嘌呤（G 或 A ) 与嘧啶 ( U 或C ) 之间，一般多将起始密码子 AUG 作为首选候选切割点之一。

(3) 对于长链 RNA 底物，既要考虑脱氧核酶臂的长度，又要考虑脱氧核酶底物结合的稳定性。通常脱氧核酶的臂长为 7~9 个核苷酸，臂过短时核酶与底物结合不稳定，不利于核酶与底物的结合；臂过长时则结合过于牢固，不利于核酶与切割产物的分离，同样影响酶效率。当然，在考虑核臂长的同时，还要考虑核酶的碱基组成。

(4) 应用在细胞内部的脱氧核酶，可以对其臂两端的几个核苷酸进行硫代修饰或甲氧基修饰以提高脱氧核酶在细胞内的稳定性。

(5) 一般需要设计 3~8 条候选脱氧核酶进行实验筛选。

(6) 目前发展了一些筛选可接近位点的方法，也可以针对获得的 RNA 可接近位点设计脱氧核酶以提高设计的准确性（参见反义核酸技术）。

2. “10-23” 型脱氧核酶体外切割活性的验证

(1) 脱氧核酶切割底物 RNA 反应体系。取 0.5 nmol/L~0.5 μmol/L 脱氧核酶和 0.2 μmol/L 底物分别加入等体积的 2X 脱氧核切割缓冲液，于 37℃ 温育 10 min 后再将两者混合，于 37℃ 温育 1 h。

(2) 加入终止缓冲液结束反应，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析脱氧核酶的切割活性。

(3) 银染或放射自显影（如果 RNA 底物用放射性同位素标记）。

3. “10-23” 型脱氧核酶体内抑制靶 RNA 基因表达活性的验证

(1) 转染细胞。将无菌的脱氧核酶直接加入细胞培养瓶中，浓度一般为 2~20 μmol/L；如果使用脂质体转染细胞，脱氧核酶的浓度可以降至 0.1~1 μmol/L。设置阴性对照。

(2) 培养 48~72 h 后收集细胞。

(3) 提取 RNA，然后采用 RT-PCR 或 Northern blot 方法检测靶 RNA 的抑制情况。

(4) 裂解细胞，提取蛋白质，采用 Western blot 方法检测靶 mRMA 表达的蛋白质水平的变化。

实验方法

脱氧核酶实验