方案26.3 旋转瓶培养
实验原理
实验材料
实验步骤
旋转瓶中的气相较大, 故用基于 Hanks 盐和空气气相的培养基,可能需要向培养瓶内充入少量 5% CO2 (如 10 L/min,2 s)。如果培养液是用 CO2/HCO3 缓冲的, 气相应该用 5% CO2 调整(20 L/min,30s~1 min,以瓶的大小决定)。
2. 将培养瓶放在旋转架上,以 20 rph 的速度转动,直至细胞贴壁(24~48 h ) 。
3. 细胞密度增大时,加快旋转速度至 60~80 rph。
4. 给细胞加培养液或收集培养液时,可将培养瓶取到无菌工作区,如通常一样排出培养液,然后更换新鲜培养液。假如体积不是关键问题,输血装置或培养液袋对于添加新鲜培养液是有用的。如果培养液容量至关重要,可用吸管滴加或用一个蠕动泵计量。
5. 收获细胞:
(a)弃去培养液,用 50~100 ml D-PBSA 浸洗细胞,然后弃去 D-PBSA。
(b)在 4℃条件下,加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋转架上以 20 rpm 将培养瓶转动 15 s。
(c)吸出胰蛋白酶,将培养瓶内的细胞消化 5~15 min,然后加入培养液。
(d)摇晃和转动培养瓶,用滴管将细胞洗出。