骨髓造血细胞的长期培养
实验原理
实验材料
试剂/试剂盒
实验步骤
2. 用 70 % 乙醇泡湿毛发,切除两侧股骨。将 10 块股骨放人盛有 Fischer 培养液(含有 16 mmol/L(1.32 g/L)NaHCO3,添加50 U/ml 青霉素和 50 ug/ml 链霉素)的 Petri 培养皿内,培养皿放在冰上。1 块股骨含有 1.5x107~2.0x107 个有核细胞。
3. 在层流超净工作台操作:
(a)用纱布和拭子清除剩余的肌组织。
(b)用解剖镊固定股骨,切断膝关节端。21G 针头应能紧紧地插人骨髓腔。
(c)切断股骨的另一端,尽量靠近末端。
(d)将股骨的一端插入盛有生长培养液的 100 ml 瓶内,抽出和推压注射器活塞数次,直至将股骨内的骨髓冲洗出来。
(e)重复操作步骤 (a)~(d),取出另外 9 块股骨内的骨髓。
4. 用 10 ml 吸管吹打大的骨髓团块,使骨髓分散成细胞悬液。
5. 按 10 ml 等量将细胞悬液分放入 25 cm2 培养瓶。不断摇晃细胞悬液,以便保证将细胞均匀地分到 10 个培养瓶中。
6. 向培养瓶中充入 5 % CO2,然后拧紧盖。
7. 在 33℃条件下,横置培养瓶,培养细胞。
8. 每周换液 1 次。
(a)轻轻摇晃培养瓶,使附着不牢固的细胞悬起。
(b)吸去 5 ml 含有悬浮细胞的培养液。注意吸管不要触到附着细胞层。
(c)向每个培养瓶中加入 5 ml 生长培养液(生长培养液:分装为 100 ml。Fischer 培养液,添加 1x10-6 mol/L 氢化可的松和丁二酸钠以及 20 % 马血清。将氢化可的松和丁二酸钠用 Fischer 培养液配制成储存液,在 -20℃ 条件下储藏)。不要将培养液直接加在附着细胞层上,以免损伤细胞。
(d)向培养瓶中充入气体后,放入培养箱。