TRlzol 试剂一步分离 RNA 实验_实验⽅法

实验原理

TRIzol 试剂是分离细胞和组织总 RNA 的即用型试剂，该试剂含有酚和硫氰酸胍单相溶液是 Chomczynski 和 Sacchi 进一步分离 RNA 方法的进一步改进。在匀浆或裂解样本过程屮，TRIzol 试剂不仅可裂解细胞，而且可保持 RNA 的完整。加入氯仿后离心，溶液则分为水相和有机相，RNA 绝大部分保留于水相，RNA 转到水相后，用异内醇沉淀以获的 RNA，移去水相后，样本中的 DNA 和蛋白质吋用连续沉淀获得。用乙醇沉淀吋在中间相获得 DNA. 异丙醇沉淀可在有机相获得蛋白质。

该技术适于在人、动物、植物、细菌少量组织（50〜l00 mg) 和细胞（5X10⁴）以及大量组织（≥lg) 和细胞（5X10⁷) 中分离 RNA，效果很好，整个过程可在 l h 内完成。用 TRIzol 试剂分离的总 RNA 没冇蛋白质和 DNA 的污染，可用于 Morrhernblot 分析、斑点杂交、pdy(A) 选择、体外翻译、RNase 保护分析、分子克隆等。TRIzol 试剂易于分离不同大小分子质量的各 RNA，如从大鼠肝内分离的 RNA, 琼脂糖电泳后，在 7kb 和 15kb 显示出了不同的高分子质量的RNA 条带，两个主要的核糖体 RNA 带在约 5kb (28S) 及约 2kb (18S) 处；低分子质量的RNA 0.1-0.3 kb (tRNA,5SRNA) .。分离的 RNA_260/280= 1.6〜1.8。每 mg 组织 RNA 的产置为：肝和脾，6〜10 ug。肾 3〜4 ug，骨骼肌和脑 1〜5 ug，胎盘 1〜4 ug。从 1X10⁶ 个细胞获得 RNA 的量是：上皮细胞，8〜15 ug；成纤维细胞 5〜7 ug。现在已冇多种 TRIzol 类似产品可供使用。

试剂/试剂盒

氯仿异丙醇乙醇无RNase的水 SDS溶液 TRIzol 试剂

实验步骤

一材料与设备

1)氯仿

2)异丙醇

3)75%乙醇（用DEPC水配制）

4)无RNase的水（将水加入无 RNase 的玻璃瓶内，加浓度为0.1 % ( V /V)的DEPC过夜，尚压灭菌）

5)0.5%SDS溶液（必须DEPC处理过的高压灭菌水配制）

6)TRIzol 试剂

二操作方法

1 . 匀浆

1 ) 组织：每 50〜l0 mg组织，加入1ml TRIzol试剂，用玻璃 -Teflcm 或电动匀浆器勾浆。样本体积不能超过 TRIzol 试剂的10%

2 ) 单层培养细胞：在 3. 5cm 的培养皿中加入 1ml TRIzol 试剂•用吸管抽吸细胞多次，直接裂解细胞。加入 TRIzol试剂的量取决于培养皿的大小（1ml / 10cm²）而不取决于细胞的量。TRIZol 试剂的量若不足，分离的 RNA 易受 DNA 污染。

3 ) 悬浮细胞：离心收集细胞，加入 TRIzol 试剂屮反复吹打裂解细胞。动物,植物,酵母每 5X10⁶～10×10⁶ 个细胞用 lml TRIzol 试剂。加 TRIzol 试剂前请勿洗涤细胞，因为这样会增加 RNA 的降解。可用勻浆器裂解细荫和酵母细胞。

2 . 相的分离

1 ) 匀浆后于 15 〜30 ℃放置 5min，以保证核蛋白复合体完全分离。

2 ) 加入 0.2m l 氯仿 /lm l TRIzol试剂。盖好样本管于 15 〜30℃ 用手剧烈摇动 15s ，放置 2〜3min。于 2〜8° C 小于 12000 g 离心 10mm。离心后、混合物分为三相：即最下层红色的酚-氯仿相，中间相以及上层水相& RNA绝大多数留于水相,水相体积用于匀浆的 TRlzol 试剂体积的 60%。

3. R N A 沉淀

1 ) 将水相移至一新管（若要分离DNA或蛋白质，保留有机相），加人异丙醇，混合均匀，以沉淀 RNA。每1ml TRizol试剂加入0. 5ml 异丙醇，于 15〜30℃ 放置 10min

2)于2 〜8℃小于12000 g 离心 10min. 离心前，常看不到 RNA 沉淀，离心后 RNA 形成胶状颗粒物.沉枳在管的底部和壁上。

4. R N A 洗涤

1 ) 移去上清液，用 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次，每 1mlTRIzol 试剂至少加入加入1ml7 5 % 乙醇混匀，于 2〜8℃ 7500g 离心5min。

2 )弃上清

5.RNA溶解

1) RNA沉淀空气干燥 5〜l 0 min。勿在真空状态下离心干燥RNA，并注意勿使 RNA 完全干燥，因为这会大大降低其溶解性。若RNA 未完全溶解，其 A_260/280 <1.6

2 ) 加入不含 RNase 的水或 0.5% SDS 溶液，反复吹打以溶解RNAg 如RNA较难溶解，可于 55〜60℃ 助溶 10min

注意事项

1)RNA 产量低：其原因可能有以下几点：样本未完全匀浆或裂解；RMA 沉淀未完全溶解。

2)A_260/280＜1.65 其原因可能有以下几点：样本太少；匀浆后，标本未室温放置水相受酚污染;RNA 沉淀未完全溶解。

3)RNA 降解：其原因可能有以下几点：从动物中取出的组织未立即加工或冻存；分离 RNA 的样本储存于-5〜一 20°C, 而不是一 60〜一 70℃：; 细胞被胰酶消化；溶液或管中含有 RNase; 用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛 PH<3.L

4)DNA 污染：其原因可能有以下几点：样本太少；用于分离的样本含有机溶剂如乙醇、DMSO) 虽缓冲液或碱性溶液。

5) 蛋白多糖和多糖的污染：下列改进的 RNA 沉淀法（步骤 3), 可从分离的 RNA 中去除这些污染物。水相中每毫升 TRIzolml 加入 0.25 ml 异丙醇，再加 0.25 ml 卨盐沉淀液 (0.8mol/L 柠檬酸钠 1.2mol/LNaCl), 混合，离心，如前所述。这样可有效沉淀 RNA 而蛋白多糖和多糖则留在液相。

6) 从少量样本 (细胞≤10⁴ 或组织≤10 mg) 中提取 RMA 时，加入 0.8 mlTRIzol 试剂，匀浆后，加入氯仿，进行 RNA 的分离，如步骤 2。用异丙醇沉淀 RNA 前，加入 5〜10 微克无 RNase 的糖原。

7) 若样本中含有高浓度的蛋白质 J 旨肪. 多糖或细胞外物质，肌肉、脂肪组织、植物茎块，则需进行额外的分离。匀浆后，2〜12000 g 离心 10 mm, 将不溶性物质去除所得的沉淀包含有细胞外膜、多糖和髙分子质量的 DNA，上清液则含有 RNA。来自脂肪组织的样本，脂肪聚集在上层，可去除. 将处理好的匀浆液移至新管，如上所述，加氯仿进行液相分离.

8）匀浆后加氯仿前样本可于-60〜- 70℃ 储存至少一个月。RNA 沉淀可在 75% 乙醇中 2〜8℃ 放置至少一个星期，- 5〜-20 ℃至少放置一年。

9) 若在步骤 2)、3) 中，离心转速为 2600 g, 时间需增加到 20〜30 min。

10)TRIzol 试剂有毒，若与皮肤接触后，用清洗剂充分水洗。若感觉不适，应速去医院。TRIzol 试剂储存于 2〜8℃ 若室温储存，有效期为 12 个月。

实验方法

TRlzol 试剂一步分离 RNA 实验