方案19.2 荧光检测支原体_实验⽅法

实验原理

在无抗生素情况下，至少将细胞培养一周，将培养上清转移至处于对数生长早期的指示细胞中，孵育 3~5d ，将细胞固定和染色，寻找细胞核之外的荧光。

实验步骤

1. 将指示细胞（如 3T6，NRK，Vero，A549）接种于培养皿（6 cm 直径）中，不要使用抗生素，接种的细胞数可以在 4~5 天产生 50%~60% 的汇合层就足够了（如 2×10⁴ NRK或 1×10⁵A549 在 5 ml 培养液中）。

2. 加入来自所测试培养物的 1.5 ml 培养液。

3. 将上述培养物进行孵育直至细胞达到 50%~60% 汇合。

4. 移去培养液，并废弃之。

5. 用 BSS-PR （无酚红的 Hanks’BSS）或 D-PBSA （无 Ca²⁺，Mg²⁺的 Dulbecco’sPBSA）冲洗单层培养物，将冲洗液废弃。

6. 加入新鲜 BSS-PR 或 D-PBSA 按 50：50 的比例用固定液（新鲜制备的冰醋酸：甲醇（1：3，置冰上））稀释，冲洗单层培养物，废弃冲洗液。

7. 加入纯固定液，冲洗，废弃冲洗液。

8. 加入更多固定液（约 0.5 ml/cm²），固定 10 min。

9. 移去固定液，并将固定液废弃。

10. 如果准备贮存，则将单层培养物完全干燥（可在这个阶段积累标本，以后再染色）。

11. 如果你要直接进行染色，可用去离子水冲洗，并废弃冲洗液。

12. 在 BSS-PR 或 D-PBSA 溶液中加入 Hoechet 33258（Hoechst 33258 染料，50 ng/ml 溶于未加入酚红的 BSS （BSS-PR）或 D-PBSA），在室温下染色 10 min 。

13. 移去染色液，并将其废弃。

14. 用水冲洗单层培养物，废弃冲洗液。

15. 加一滴封固剂（缓冲液配制的甘油溶液）封固盖玻片，擦去来自盖玻片边缘的多余封固剂。

16. 用 330/380 nm 激光滤片和 LP 440 nm 屏障滤片，对单层培养物进行荧光检査。

注意事项

如果培养物在测定结束前达到完全汇合，染色将被抑制，支原体的观察很困难。

实验方法

方案19.2 荧光检测支原体