方案16.8 细胞系的多位点DNA指纹检测_实验⽅法

细胞系 Southern 印迹 DNA 的制备

实验原理

细胞中提取的 DNA 经限制性酶消化，利用 Southern 印迹技术将消化产物固定在尼龙膜上 [ Ausubel et al.，1996，2002 ]，与来自 M 13 噬菌体的标记 DNA 进行杂交。

实验材料

D-PBS HinfI酶及其缓冲液琼脂糖凝胶 5×TBE储存液 EDTA二钠盐 6×上样缓冲液 2×SSC 20×SSC

试剂/试剂盒

实验步骤

1. 约10⁷ 个细胞（用细胞刮或胰蛋白酶消化收集）用 D-PBSA （不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液，PH 7.2）洗涤 2 次至细胞团块。

2. 提取高分子量基因组 DNA，取一小部分用小型凝胶电泳来检测 DNA 的完整性，如步骤 6 中所述，常规用于细胞系，并可避免使用酚的 DNA 抽提术，见 Stacey 等 [1992] 的描述。

3. 取 1：50 稀释液，用紫外线分光光度计测定 DNA 含量 [ Sambrook et al.，1989 ] 。

4. 将 5 μg DNA 和 40 U HinfI 酶、3 μl 10× 酶缓冲液（例如，Life Technologies）及无菌蒸馏水混合配成总体积为 30 μl 的混合液。

5. 混合液 38°C 孵育过夜，重新混匀，1 h 后离心消化产物。

6. 取 1 μl 消化产物加人电泳缓冲液（1× TBE（pH 8.2，54 g Tribase (Sigma)，27.5 g 硼酸（Sigma）和 20 ml 0.5 mol/L 的 EDTA 二钠盐（sigma））和 2 μl 的 6× 上样缓冲液（冲洗 0.25 % （W / V）溴酚蓝，0.25 %（W / V ）二甲苯兰和溶于蒸馏水中的 40 % （W / V ）蔗糖），经小型琼脂糖凝胶电泳（0.7 % 琼脂糖（1A 型，Sigma）溶于 1× TBE，1 mg/L 溴乙啶）检测是否消化完全。HinfI 酶消化应出现低分子量 DNA 片段拖影（5 < kb )，而无残存的基因组 DNA 条带（20~30 kb )。

7. 在剩下的消化产物中，加人 6 μl 的 6× 上样缓冲液混匀，将其点样于分析用的琼脂糖凝胶（0.7 %，1× TBE，含 1 mg/L EB，至少 20 cm 长），平行的有 HindⅢ 的消化标记物及来自标准细胞系（如 HeLa） 0.5 μg DNA 消化产物。以大约 3 V/cm 进行电泳，直至 2.3 kb 的 HindⅢ 片段跑完凝胶全长（即 17~20 h 后），加白色标尺作对比，通过紫外光透射仪对凝胶拍照，记录区带迁移距离。

8. 先用酸性洗液（0.1 mol/L HCl 500 ml）处理分离后的 DNA 片段（15 min），再碱性洗液（0.2 mol/L NaOH，0.6 mol/L NaCl 500 ml）处理（30 min），最后用中和洗液（pH 7.6，1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris 500 ml）处理（30 min）。参考Sambrook 等 [1989] 的方法，最简单的方法是用 20× SSC 转移缓冲液（175.3 g NaCl （Analar，Merck）和 88.2 g 柠檬酸钠（Analar，Merck）溶于蒸馏水中，定容至 1.0 L，PH 7.2），利用毛吸作用，使琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上（HybondN，Amersham），然后以 2× SSC （由 20× SSC 储存液稀释10倍）冲洗该膜，干燥，用莎纶膜（Dow）或类似物包裹。

9. 使用紫外光透射仪（例如，TM 20，UVP Inc），将 DNA 片段暴露于紫外线（302 nm）下 5 min，将其固定在膜上。

10. 在进行杂交前，已固定的膜应置于干燥的塑料袋中避光保存。

注意事项

1. 溴化乙啶是一种潜在致癌物。

2. 涉及放射性物质的操作，应该按照国家和当地条例进行操作，开展这样的工作之前要向当地生物安全部门咨询。

实验方法