材料

无菌

1. HBSS/PSG: 添加 lOOU/ml 青霉素、3ug/ml 链霉素和 25ug/ml 庆大霉素的 HBSS。
2. 消化混合液：含有 150U/ml XI 型胶原酶、40ug/ml dispase 和 1% FBS，用 DMEM 配制。
3. 生长培养液：DMEM，添加 25 mmol/L 葡萄糖、6.8 mmol/L 丙酮酸盐、0.25U/ml 胰岛素、50ng/ml EGF、2.5% FBS 和上述 HBSS 中的抗菌素，在 7.5% CO₂ 条件下用碳酸氢钠调整 pH 至 7.4。
4. S-DMEM： 含有 2% 山梨糖醇的生长培养液，过滤灭菌

以上液体应为 37℃

5. 90 mm Petri 培养皿 

6. 普通容器或 30～50 ml 离心管 

7. 24 孔培养板，用胶原蛋蛋白预涂：
(a) 稀释 10X Vitrogen 储存液；
(b ) 每孔加入 0.5 ml Vitrogen，孵育 3 h；
(c) 吸去多余的 Vitrogen，将培养板放入层流超净工作台，风干。

8. 可用保鲜膜（Saran Wrap) 包裹，在 37℃ 条件下保存，于 1 周内使用。

9. 25 cm² 培养瓶 

10. 手术刀（4 号刀柄，22 号刀片）

11. Moveue 吸管或类似的大孔径吸管

二、操作步骤

人结肠隐窝的分离

1. 从病人切除结肠后，尽快将组织放人 DMEM 中。初步研究表明，只要尽快放人 DMEM，结肠组织可在 4℃ 条件下短时间内（2 h) 保存，但不应保存更长时间。

2. 用 1X HBSS/PSG 清洗结肠组织 2 次，以清除污染物。 

3. 将结肠组织移入盛有 HBSS/PSG 的干净 Petri 培养皿。

4. 尽量除去平滑肌，用两把相对的手术刀将组织切成小块。

5. 将组织块移入盛有 20 ml HBSS/PSG 的 25 cm² 培养瓶，通过用 Movette 吸管吹打冲洗组织块。

6. 让组织块沉下，然后吸去 HBSS/PSG。

7. 重复冲洗，直至 HBSS/PSG 清澈。常需重复冲洗 5 次。

8. 将组织块移入 Petri 培养肌，并吸去多余的 HBSS/PSG。

9. 用手术刀修切组织块，使组织块面相当平。用大口径吸管将组织块移入 25 cm² 培养瓶。须提前用 HBSS/PSG 将吸管内面弄湿，以防组织块粘贴吸管。

10. 静置组织块，然后吸去多余的 HBSS/PSG。

11. 加人 25～30 ml 混合消化液。

12. 在 37℃ 条件下孵育 1 h 。

13. 换混合消化液：
(a) 让组织沉下。
(b) 轻轻从培养瓶吸去混合消化液，勿吸去未被消化的组织块。
(c) 加人混合消化液，在 37℃ 条件下继续孵育 1～2 h 。
(d ) 每 15～30 min 检查组织 1 次，勿使隐窝过度消化。约 70%～80% 隐窝分离时，消化过程即结束。

其他说明 不要等到全部隐窝被分离，由于过度消化反而导致得到的隐窝减少。
人结肠隐窝的沉降

用山梨糖醇沉降法纯化已分离的隐窝。在沉降管顶部可见到较大的脂肪和间质组织的凝集物。由于凝集物会影响沉降，应在开始几个步骤将凝集物除去。

14. 将培养瓶内消化的组织悬液分人两只 30 ml 无菌离心管，标为「 Set1」。

15. 在组织悬液上面加 S-DMEM 至 25 ml，然后除去漂浮的脂肪或间质组织。

16. 让组织悬液静置 1 min ，以便使未消化的组织沉降。

17. 除去漂在上面的脂性物质，然后轻轻将上层悬液移人两只离心管，标为「 Set 2」。 

18. 让悬液静置 30s。

19. 将上层悬液移人两只离心管，标为「 Set 3」。

20. 在悬液上面加 S-DMEM。

21. 离心（200～300 g，4 min)

22. 吸去上清液。

23. 轻弹离心管底部，使聚集的隐窝分散。

24. 重复用 S-DMEM 混悬隐窝，然后离心。S-DMEM 清洗和离心步骤须重复 5 次左右，直至上清液清澈。

25. 应在显微镜下检查 Set1 和 Set 2 离心管中的沉降组织内是否含有隐窝。如含有隐窝较多，将沉降组织摇匀，从步骤 14 开始重复沉降。如仅含有未消化组织，可将其丟弃。

26. 上清液变清澈时，准备种植隐窝。为了使细胞生长良好，需要合适的种植密度。一般情况下，按每孔（24 孔培养板）800～1000 个/ml 密度种植时隐窝生长最好。按下列方法确定隐窝密度。
(a) 用 10 ml 生长培养液混悬分离的隐窝，然后摇匀。
(b) 取出 100ul，加入 900ul 生长培养液。
(c) 从上液中取 100ul 悬液，计数隐窝。每毫升悬液的隐窝数目 = 计数的隐窝数目 X 100

27. 在 37°C 和 7.5% C0₂ 条件下孵育 2d，让细胞贴壁。

28. 从培养板吸去含有未附着细胞的培养液，换入新鲜培养液。

29. 每隔 5 天补充 0.5 ml 新鲜培养液。