灭菌

无血清角质形成细胞培养液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics): 含有 0.15 mmol/LCa^2-、0.1ng/ml 人上皮生长因子、5ug/ml 胰岛素、0.5ug/ml 氢化可的松和 30ug/ml 牛垂体提取物。

EMEM(Eagle'sminimalessentialmedium)

D-PBSA：不含 Ca²⁺和 Mg²⁺的 DulbeccoPBSA 液 FBS

胰蛋白酶和 EDTA 混合液：0.05% 胰蛋白酶，0.5 mmol/L EDTA
纤连蛋白和胶原蛋白混合液（fibronectin/collagen，FNC)：10ug/ml 纤连蛋白、35ug/ml 胶原蛋白和 lOOug/mlBSA。BSA 作为稳定剂

Biocoat 6 孔培养板：涂有鼠尾 I 型胶原蛋白（B-D Biosciences)

二、操作步骤 

原代培养 

1. 将供体角膜放于消毒过的物品上，上皮面朝上，用手术刀切成 12 个三角形组织片。应一刀切下去，避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原蛋白基质的破坏和成纤维细胞的脱落。

2. 将角膜组织片的上皮面翻向下，放入用鼠尾 I 型胶原蛋白预涂的 6 孔培养板，每孔放 4 个组织块。

3. 用镊子轻压组织片，以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置 20 min，使其变干。

4. 将一滴 KGM 轻轻滴于组织片上，在 37°C 和 5%CO₂ 条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用含有抗菌素的培养液（McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的，但全部操作应在无菌条件下进行。

5. 第 2 天，在培养皿中加人 lml 培养液。在培养早期，可观察到细胞仅从角膜缘处迁出，但没有细胞从角膜中央部或巩膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙（0.15 mmol/L)，减少胶原蛋白基质降解，故这种培养液可减少成纤维细胞长出。

6 在植入角膜组织片后第 5 天，用镊子将组织片取出，再加人 3 ml 培养液。取出组织片后，贴壁细胞继续增殖。培养后第 2 周，细胞生长形成单层，呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得 1X10⁶〜5X10⁶ 个上皮细胞。

扩增培养

7. 取出组织片后，每周换液 2 次。

8 当细胞汇合达 70%〜80% 时，用 D-PBSA 浸洗细胞。然后，在 37°C 条件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液处理 4 min。

9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 终止消化。

10 将细胞离心后，用 KGM 混悬。计数细胞，以 1X10⁴ 个/cm² 密度将细胞接种于涂有 FNC 的培养皿。

11 在 37°C、95% 空气和 5%CO₂ 条件下培养。

12. 胰蛋白酶处理和种植 1d 后换培养液。

传代后不久，上皮细胞呈长梭形，折光，迁移能力较强。传代后第 1 周，细胞汇合达 70%〜80% 时呈卵石状排列。如果形成单层后继续培养，细胞能生长成散在的复层结构。

尽管角膜上皮细胞能传至 5 代，约倍增 9〜10 倍，但大多数细胞增殖发生在第 1〜3 代。每个角膜约获得 1X10⁶〜2X10⁶ 个上皮细胞。细胞常在第 5 代开始衰老。