材料：
无菌
生长液:
胰蛋白酶（0.25% + EDTA ，1 mmol/L ，溶于 PBSA 中）

MTT : 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2, 5-二甲苯基溴化四唑，50 mg/m l, 滤过, 除菌。
Sorensen 甘氨酸缓冲液（0.1 mol/L 甘氨酸，0.1 mol/L, NaC l，用 1 mol/L Na(OH) 将 pH 调至 10.5)
微滴定板（Iwaki)

微量吸头，最好放在高压灭菌的吸头盒中

5 cm 和 9 cm 培养皿（未经 T C 处理的）或储液器（Corning)

30 ml 和 100 ml 通用容器或试管
 

非灭菌

塑料盒（无毒的聚苯乙烯，装培养板用）

多道加样器

二甲基亚砜 (DMSO) DMS( ) 分装器:Labsystems Microplate Dispenser (Cat No 5840127，Thermo Electron)

ELISA 读板仪（Molecular Devices，with SOFT max PRO ; 见附录Ⅱ )

离心用的板架（用于悬浮生长的细胞）

操作步骤

接种细胞

1. 用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。

2. 离心细胞悬液（5 min ，200 g )，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。

3. 将细胞稀释至 2.5 X10³~50 X10³ 个/ml，这要依细胞系的生长速度而定，每个微滴定板可以容纳 20 ml 细胞悬 液。

4. 将细胞悬液移至 9 cm 培养皿中，用多道加样器在平底 96 孔板中间 10 列的各孔中加人 20 ul 细胞悬液（每板 80 孔），从第 2 列开始到第 11 列为止，每孔加入 0.5X 10³~10X 10³ 个细胞

5. 将 200ul 培养基加至第 1 列与第 12 列的 8 个孔中。第 1 列用作读板仪的空白对照，第 12 列有助于维持第 11 列的湿 度，并将「边缘效应」（edge effect) 减至最小。

6. 将培养板放至塑料饭盒中，于 37℃：湿润环境中温育 1~3 d ，等细胞进入指数生长期时可加入药物。

7. 对于非黏附细胞，用新鲜培养基制备细胞悬液，将细胞稀释至每毫升 5X 10³~100X 10³ 个/m l，仅取 100 ul 细胞 悬液接种于圆底 96 孔板，之后立即加入药物。

添加药物

8. 用培养基将细胞毒性药物 5 倍系列稀释，共制备 8 个浓度。选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低 浓度时不会杀死细胞为标准。只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。一般情况下，每种药物使 用 3 块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。

9. 对于贴壁生长的细胞，去除第 2-11 列各孔中的培养基，这可以通过将皮下注射器针连在吸引管上完成。

10. 在第 2 列和第 11 列的 8 个孔中加人 200^1 新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。

11. 在第 3~10 列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需 4 个孔，这样 A-D 行可用于第一种药物，E ~H 行用于第二种药物。

12. 将药物溶液移至 5 cm 培养皿中，用 4 道加样器向每组的 4 个孔中各加入 200 ul。

13. 将培养板放回塑料盒中，温育至确定的暴露时间。对于非黏附细胞，将药 物稀释至预期终浓度的 2 倍，取 100^1 加入已含 100^1 细胞的孔中。

生长期

14. 在药物暴露期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入 200 ul 新鲜的培养基。若是非黏附细胞，离心培 养板（5 min ，200 g )，使细胞沉淀下来。然后用细针头吸去培养基，不要扰动细胞团。

15. 每日换液至 2~3 个 P D T 。

存活细胞数的估算

16 . 在生长期末，每孔中各加人 200 ul 新鲜的培养基，在第 1-11 列所有孔中各加人 50 ul MTT 。

17. 以铝箔包裹培养板，于 37℃湿润环境中温育 4 h 。请注意 4 h 是所需的最短温育时间，可延至 8 h 。

18.. 弃去孔中的培养基和 (非黏附细胞则离心），在第 1-11 列所有孔中各加入 200ul DMSO , 以溶解残留的 MTT - 甲腊结晶。

19. 在含 DMSO 的各孔中加人甘氨酸缓冲液（每孔 25 ul )。

20. 立即在 570 nm 处记录吸光值，因为产物不稳定。读板仪用第 1 列中含培养基和 MTT 但不含细胞的各孔调零。

MTT 试验分析

21. 以药物浓度为横坐标（X 轴），吸光值为纵坐标（Y 轴）绘制曲线图。

22. 第 2 列和第 11 列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为 IC50 浓 度。偶尔结果并非如此，这表明整个板中所接种的细胞数不一致之故。

23. 得到吸光值的绝对值，以此作图，这样才能与对照吸光值比较，然后要将数据转化成百分率抑制曲线 (图 22.6)， 从而使一系列曲线标准化。
 

2. 严格进行无菌操作，防止细菌、真菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时，避免瓶口和吸管接触碰撞。