实验方法

化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法

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化学法测定DNA含量可以用于:(1)转化、转染之前的质粒浓度估测;(2)对获取的DNA含量进行检测。

化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法

实验原理

DNA 在酸性条件下加热,其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂,生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸,而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖,与二苯胺试剂反应生成蓝色物质,在595nm 波长处有最大吸收。DNA 在40-400μg 范围内,光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。

实验材料

DNA样品

仪器/耗材

分光光度计 水浴锅

实验步骤

1. 制作DNA 标准曲线:取12 支洁净干燥试管加入DNA标准溶液,加完各试剂后,充分混匀。于60℃水浴中保温1h,冷却后于595nm 波长处以1,2 管为空白调零,测定各管光密度(OD595nm)。取两管的平均值,以DNA 的含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线。


2. 样品DNA 含量测定:取2 支干净试管 加入样品试剂,其它操作同上。待测溶液中的DNA 含量应调整至标准曲线的可读范围内。


3. DNA 含量计算:以样品的光密度,从标准曲线上查出相对应DNA 含量,计算出样品中DNA 的百分含量。

注意事项

二苯胺试剂具有腐蚀性,且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色,操作中应防止洒出,比色时,比色杯外面一定要擦干净。

其他

二苯胺主要用于合成橡胶的防老剂、燃料和医药中间体,润滑油抗氧剂,也是火药的稳定剂。硝酸盐、氯酸盐和其他氧化性物质的检定。铱的催化测定。硝酸盐的光度测定。氧化还原指示剂。单倍体育种培养基。制造染料。是硝化纤维素、炸药、火棉的稳定剂。

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