血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
实验原理
根据凝胶形状不同分为盘状电泳和板状电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管中，利用不连续的缓冲液pH值进行电泳而命名，同时，样品混合物分开形成的带很窄，呈圆盘状，因此圆盘电泳这个名字成了不连续性和盘状的双关语。不连续盘状电泳具有很高分辨力，这是由于有三种效应存在、浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
1.浓缩效应：
管中装有三种不同的凝胶层，见附图，上层为样品胶，第二层为浓缩胶，这两层均为大孔胶、其缓冲为Tris-HCL缓冲液pH值为6.7。第三层为分离胶，该层为小孔胶Tris-HCL缓冲液，pH8.9。在上下电泳槽中充分以Tris-甘氨酸缓冲液，pH值为8.3。这样造成凝胶孔径、pH值、缓冲液的不连续性。在此条件下，HCL几乎全部电离为Cl-，甘氨酸有极少部分的分子解离成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白质也能解离而带负电荷。当电泳系统通电后，这三种负离子同向正极移动。根据有效泳 动率的大小，最快的称为离子或先行离子(这里指Cl-)，最慢的称为慢离子或随后离子(这里是NH2CH2COO-)。电泳开始后，快离子在前，在它之后形成一离子浓度低的区域，即低导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，则在快离子和慢离子之间造成一个不断向阳极移动的界面，由于蛋白质的有效泳动率恰好位于快、慢离子之间，因此蛋白质样品被夹在当中浓缩成一狭窄层，这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
2.电荷效应：
蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷 不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质样品按泳动率快慢顺序排列一个一个的圆盘区带。在进入分离胶时电荷效应仍起作用。
3.分子筛效应：
当被浓缩的蛋白样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的pH值8.9(电泳时实际测量是9.5)，使接近甘氨酸的pka(9.7～9.8)，这样慢离子解离度增大，因而其泳动率也增加，此时慢离子泳动率超过所有蛋白质的有效泳动率，高电压梯度不复存在。此时各种蛋白质不仅由于其分子量或构型不同，在一个均一的电压梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，表现泳动率不同而被分开。
实验步骤
1.分离胶缓冲液(pH8.9)：取Tris36.3克加入1NHC148ml，再加水到100ml。
2.单体交联剂：取丙烯酰胺30g，N-N-亚甲基双丙烯酰胺0.8g，加蒸馏水到100ml。
3.浓缩胶缓冲液(pH6.7)：取Tris5.98g加1NHC148ml，加蒸馏水到100ml。
4.加速剂：四甲基乙二胺。
5.催化剂：10%过硫酸铵，取AP1克加水到10ml。临用前现配。
6.电极缓冲液(pH8.3)：称取Tris6g，甘氨酸28.9g溶解后加蒸馏水到100ml，用时稀释到1000ml。
7.0.5%氨基黑染色液：取考马斯兰R-250 0.5g，7%冰乙酸10ml，溶解后加水100ml，混匀。
8.7%乙酸：取含量37%的乙酸19ml加水至100ml。
9.20%蔗糖100μl与0.025%溴酚兰5μl组成样品稀释液。
二、凝胶柱的制备
1.取0.5×100cm的玻管，从另一端量取7cm、8cm两处，分别用玻璃铅笔划线，起端管口用小块玻璃纸包封好，插入橡皮垫，垂直立于试管架上。
2.取小烧杯2个，标号，先按表配制分离胶，待分离胶聚合后再配浓缩胶。
注意抽除溶液中气泡
3.取1号杯混匀溶液后，用滴管吸取加入上述玻璃管至刻度(离底端约7cm)再以玻璃管小心在胶液上覆以0.5cm厚度的水层，将此玻璃管垂直放在试管架上，约半小时以上，凝胶聚合完成后，用滤纸吸去覆盖的水层，这是分离胶。按表配制浓缩胶，摇匀，用滴管吸此液加于上述凝胶层，至第二刻度(8cm处)。同样覆盖0.5cm厚水层，垂直放于试管架上。聚合后，用滤纸吸去水层，这是浓缩胶。
三、加样
血清中加1/3体积50%甘油或20%蔗糖溶液，加入少量0.5%溴酚蓝作追踪剂，混匀，吸此样品30～50μ加在浓缩胶上。沿管壁加入电极缓冲液，直至项端。
四、电泳
1.将制备好的凝胶柱分别插入电泳槽底部的小孔，凝胶管垂直在上槽和下槽中，做好标记。加好上、下槽电极缓冲液(Tris-甘氨酸)，插上电极，上负下正。
2.将电流调至3mA/管，电压100～200V，当溴酚蓝追踪剂接近管底时(约电泳30分至1小时)，切断电源，将凝胶管取出(缓冲液倒入回收杯)。
五、剥胶
取下凝胶管，用带有10cm长针头注射器，内盛蒸馏水作润滑剂，将针头插入胶柱与管壁之间，边注水边旋转玻璃管，直至胶柱与管壁分开，用洗耳球轻轻在一端加压，使胶柱从玻璃管中慢慢滑出。
六、染色与脱色
从管中取出凝胶柱浸入0.5%～1%氨基黑染液中，一般染色约10～15分钟，但有的蛋白质需要更长时间。染色后用水冲去多余的染料，放入7%乙酸中脱色，直至余下黑色全部脱去为止。约30分钟。
