机械法
实验原理
这是一种快速简便提取植物总DNA的方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨,以机械力破碎细胞壁,然后加入十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液,使细胞膜破裂。同时将核酸与植物多糖等杂质分开(十六烷三甲基溴化铵,简称CTAB,是一种阳离子去污剂),再经氯仿-异戊醇抽提去除蛋白,即可得到适合于酶切的DNA。
实验材料
实验步骤
一、实验试剂及材料
1. 材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。
2. 试剂:液氮,CTAB抽提缓冲液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵),1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0,3M NaAC,50mM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA,氯仿:异戊醇(24:1),异丙醇 ,70%乙醇,TE buffer。
二、实验方法
1. 取0.5 g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干。
2. 植物材料剪成1 cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中。
3. 加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好)。
4. 在5 ml离心管中加入抽提缓冲液2.5 mll,60℃保温1小时。
5. 15 000 rpm,离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。
6. 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),混匀抽提至水乳胶融状。
7. 15 000 rpm,离心10分钟。
8. 上清转入另一个新的离心管中。
9. 加入2/3倍体积预冷异丙醇,-20℃保温30 min-1 h,缓缓混匀DNA成絮状折出。
10. 15 000 rpm,离心10分钟,弃上清。
11. DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。
12. 加入400 ul TE buffer溶解DNA。
注意事项
真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA。