实验方法

细胞瞬时转染

难度系数: 暂无得分

收藏

细胞瞬时转染可用于(1)观察目的基因功能(2)表达蛋白在某种细胞中的功能(短时间即可进行观察,但效应会很快丢失)。

细胞瞬时转染

实验原理

通过脂质体介导转染法及电穿孔等基因转染技术,将靶基因导入细胞,一般在转染后48小时左右,靶基因即可在细胞内表达。根据不同的实验目的,48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。

实验材料

细胞样品

试剂/试剂盒

FuGENE 6 脂质体

仪器/耗材

电穿孔

实验步骤

一般流程:


1)细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖。


2)细胞转染(脂质体、电穿孔、FuGENE6等)


3)48小时以后鉴定目的基因的表达情况。


前期准备:


l构建好的外源基因载体,或目的基因基本信息。


l待转染的细胞系(1×106个细胞,可传代,倍增时间小于48小时)以及细胞培养条件的说明。


l若需要检测靶基因的表达,请提供相应抗体。

注意事项

1. 转染48——72h后可检测基因表达。如用于重组蛋白、抗体生产等。


2. 由于各实验操作细节可能不同,建议转染前可做优化实验,确定sinofection转染试剂与DNA的最佳比例。


3. 如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。

其他

在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

经验交流

写下你对该实验的感想吧,让更多人看到