HPLC-MS/MS法
实验原理
实验材料
试剂/试剂盒
实验步骤
1. 前处理
称取10 g样品，准确加入内标溶液（13C-己烯雌酚、13C-睾酮、13C-雌二醇）（20 ng/mL）0.5 mL，加入10 mL pH5.2的乙酸钠-乙酸缓冲溶液，匀浆后，再加入β-葡萄糖酸苷酶-硫酸酯酶溶液10 uL，于（37±1）℃振荡酶解过夜。取出冷却后，加入36 mL甲醇振荡提取30 min，转入离心管2000 g离心10 min。上清液中加入40 mL正己烷提取两次，弃去正己烷层。水-甲醇层中加入0.5 mL正丙醇，50 ℃旋转蒸发去掉甲醇。
HLB固相萃取柱（6 mL， 500 mg）用6 mL甲醇、6 mL水活化。将旋转蒸发后溶液中加入50 mL水，以2～3 mL/min的速度过柱，用6 mL水洗潘后，萃取柱用氮气吹干。用10 mL 5 mmol/L三乙胺甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹干，加入0.3 mL三氯甲烷溶解残渣，再加入3 mL正己烷用于下一步净化。
桂胶固相萃取柱（6 mL，500 mg）用6 mL正己烷活化，溶液过柱，用5 mL正己烷洗涤。用6 mL水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱液氮气吹干，用2 mL甲醇-乙酸乙酯（40 + 60）溶液溶解，以备过氨基柱。
氨基柱（6 mL，500 mg）用3 mL甲醇-乙酸乙酯（40 + 60）溶液洗涤，3 mL水饱和乙酸乙酯活化，将上步溶液过柱并接收，再加入3 mL甲醇-乙酸乙酯（40 + 60）溶液洗脱接收，氮气吹干后，加入0.5 mL流动相溶解上机测定。
2. 测定
（1）雄激素测定液相色谱条件色谱柱：苯基柱（2.0 × 250 mm，5 um）；流动相：甲醇-水，梯度淋洗，初始条件为65%水-35%甲醇，保持3 min，27 min线性梯度使甲醇比例为100%，保持5 min，1 min内甲醇比例降到35%，保持20 min到下次进样。流速：0.2 mL/min。
（2）雄激素测定质谱参考条件电离源：电喷雾正离子模式；毛细管电压：3.5 KV；锥孔电压：70 V；射频透镜1电压：30 V；射频透镜2电压：0.5 V；源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：300 ℃；脱溶剂气流量：400 L/h；电子倍增电压：650 V；喷撞室压力：2.8 × 10-3 mbar；
（3）雌激素测定液相条件色谱柱：苯基柱（2.0 mm × 250 mm， 5 um）；流动相：乙腈-水，梯度淋洗，初始条件为65%水-35%乙腈，保持3 min，27 min线性梯度使乙腈比例为100%，保持5 min，1 min内乙腈比例降到35%，保持20 min到下次进样。流速：0.2 mL/min
（4）雌激素测定质谱条件电离源：电喷雾负离子模式；毛细管电压：3.1 KV；维孔电压：80 V；射频透镜1电压：40 V；射频透镜2电压：0.5V；源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：300 ℃；脱溶剂气流量：400 L/h；电子倍增电压：650 V；喷撞室压力：2.8 × 10-3 mbar。
