实验方法

染色体基因定位实验

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染色体是由包含基因组成的实体,显微镜下所见仅为大体结构。基因是分子水平的核苷酸序列,能否使之成为显微镜下可见物用特殊的方法也可使之在染色体上显现出来和确定某一基因在某一号染色体上的位点, 此种方法称基因定位。内容来源:组织培养和分子细胞学技术。(北京出版社)

放射性核素标记染色体原位杂交基因定位法

实验原理

基因是由平均1000~3000核苷酸组成的序列,在光学显微镜下是难以识别的。为显示染色体上特定基因必须具备以下三个重要条件:

1.  需要具有能与目的基因相特异接
合(互补)的核苷酸序列即探针(Probe);

2.  需要有能与探针相结合的标记物(常用同位素
和荧光素);

3.  制备出良好的染色体标本。

在进行定位时,首先要使标记物与探针相接合(Lable:标记),形成探针/标记物复合物,然后再使复合物与染色体DNA 进行杂交(Hybridization)。所谓杂交,即两条来源不同的单链DNA能互补形成双链DNA的过程。在一般情况下,染色体上被定位的目的基因和探针都是双链状态的DNA,两者杂交只有在解链状态下,即都变成单链时才能发生。温度是使双链DNA解链的条件,在80 ℃温度下DNA即发生解链(变性)。因此当把染色体与探针置于同温条件下,两者便同时解链成为单链DNA;当温度下降时,两者DNA又重新恢复双链状态(复性);在复性中探针的单链即可与目的基因单链发生杂交。由于探针DNA 携有标记物,用相应的方法能使标记物显现成为可见形态。在用同位素作标记物时,可用放射自显影法显现探针/同位素;用荧光素作标记物时,探针/荧光素能在荧光显微镜下发光,从而可观察到和确定探针的位点(也即目的基因存在位点)。标记探针与染色体基因(或细胞质mRNA)杂交定位法称原位杂交(In Situ Hybridization)。

实验材料

染色体标本

试剂/试剂盒

放射性核素

实验步骤

一、放射性核素探针掺入程序

1.  探针制备

2.  缺口翻译

(1)同位素减压浓缩

取3H-dTTP(1 μC/ml)50 μl~100 μl,置入Eppendorf管中真
空中减压抽干;

(2)缺口翻译反应

另取探针DNA1 μg加入Eppendorf管中,再加入10×缺口翻译
缓冲液5 μl;

缺口翻译缓冲液组成为

 
Tris-Cl 缓冲液 0.5 M

MgSO4 0.1 M

二硫苏糖醇 1 mM

牛血清白蛋白 500 μg/ml

(3)再加入dATP、dGTP、dCTP 各1 mM;用蒸馏水稀释至50 μl;

(4)混合

移入已真空干燥含有3H-dTTP的Eppendorf管中,混匀;

(5)加酶

加入DNA 聚合酶I、DNA多聚酶I各1 ml,封口;

(6)反应

16 ℃中反应10 分钟,加0.5 M EDTA终上反应;

(7)探针分离

将上述反应液加入Sephadex G50层析柱中,用TE洗脱分离。

二、探针与染色体分子原位杂交

1.  杂交液配制
 
3H 标记探针 1.0 μg/ml

甲酰胺 50.0 %

硫酸葡萄糖 10.0 %

EDTA 5.0 mM

聚乙烯吡咯烷酮 0.04 %

聚蔗糖 0.04 %

牛血清白蛋白 0.04 %

氯化钠 300 mM

柠檬酸钠 300 mM

磷酸盐缓冲液 20 mM

小牛胸腺DNA 50 μg/ml

以上成分相混合,pH7.0±0.1。
 
2.  探针变性

将杂交液混合,置于70 ℃水浴中,作用5 分钟后,再把含有杂交液的小管插入碎冰中。

3.  染色体DNA 变性
 
(1)在每张染色体标本上,加100 μg/ml RNA酶50 μl(为去除RNA),置一盖玻片,置于潮湿皿中,37 ℃孵育1 小时;去除盖片,浸入2×SSC 缸中漂洗4 次;

(2)脱水

过70%、80%,90%、100%酒精脱水;

(3)变性

置染色体标本入2×SSC 甲酰胺溶液中,70 ℃处理2 分钟(不能过长);

(4)迅速投入30%冷乙醇溶液中;

(5)脱水

同(2);

(6)干燥

自然干燥。

4.  探针与染色体杂交

(1)每一染色体标本上加杂交液50 μl,覆一盖片;42 ℃于潮湿皿中杂交16 小时;

(2)洗脱

30~40 ℃下,50%甲酰胺溶液中洗5 次、2×SSC 溶液中洗5 次,0.1×SSC
溶液洗3 次(洗脱过分影响杂交率);

(3)脱水

与前相同;

(4)干燥

自然干燥。

5.  放射自显影
 
(1)涂片

用国产核子乳胶(1:1)稀释液涂片;

(2)曝光

4 ℃冰箱中曝光10 天后(比活性10cpm/μg 以上),取出;

(3)显影

用D19B 显影液,显影2~5 分钟;

(4)定影

柯达F-5 定影液定影10 分钟;

(5)水洗

15 分钟。

6.  染色体显带
 
(1)置已曝光片子浸入下液中
 
Na2SO4 50.0 mM
 
Na2B4O7 2.5 mM
 
37 ℃,预处理10~30 秒;

(2)染色

迅速漫入10%Giemsa染色液中染2~3 分钟;

(3)水洗、干燥、镜下观察。

其他

一、结果

成功情况下可见:染色体分带良好、除染色体外,在各处可见散在的、直径1~3 微米的黑色圆形颗粒,有的颗粒位于染色体上,有的位于染色体间。观察50~100 个分裂相,并统计颗粒存在于某号染色体上规律性位点、统计、在特定染色体的特定位点出现机率占8%~40%以上者,可视为该基因的位点。


二、讨论

染色体DNA变性充分,利于与探针杂交,但变性过度不利显带。变性中加70
%甲酰胺效果较好,能保证在较低温度下进行变性和维持染色体形态。杂交液中加10%的硫酸葡聚糖较好,有提高杂交率作用,但不能过高,否则本底亦高。探针浓度亦应适当,过低需延长曝光时间,本底随之增加;过高探针可自相结合影响杂交率。加入探针的量与DNA片段大小有关,经验数值是,10 kb片段DNA浓度应为0.5~0.05 mg/L。

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