非程序DNA合成检测实验
实验原理
在一般情况下细胞内DNA合成只见于S期，但当处于非S期细胞DNA受损伤时，随着DNA损伤的修复也将发生DNA合成现象，即UDS。
在化学致突变物、致癌物作用诱发细胞DNA损伤时，也诱导DNA出现UDS现象。
因此，UDS是检测环境致突变物、致癌物的短期测试方法之一。
如被检物具有致突或致癌性，当把同位素标记的DNA前体物加入培养环境中，受损DNA仍能在DNA 合成期外，以半保留复制的方式把DNA前体掺入到DNA链中，遂可应用同位素技术检测出来。
实验材料
实验步骤
一、实验组合
为证实被检物作用的确切性，应做如下实验组合安排
2. 抑制DNA 合成
弃旧培养液，加入不含精氨酸的EMEM培养液，继续培养20～24 小时；
3. 加测试物
加入10 mM羟基脲（阳性对照加MNNG），培养2 小时；
4. H-TdR处理
2、3、4 每皿内加3H-TdR（5 μC/每皿）后，培养20～24 小时；
5. 漂洗
去除培养液，用不含钙、镁BSS漂洗；
6. 制片
制备放射自显影标本方法（参考原位杂交基因定位法）固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色；
7. 观察
在油镜下计数，首先要排除S期半保留复制细胞（为银粒密集覆盖的细胞核），只计数核上的银粒数目，再扣除本底（每例计数30～50 个细胞），结果以银粒数/核的均值或含10 个银粒左右细胞的百分率表示。
三、液闪计数法
1. 细胞培养和处理
人二倍体成纤维细胞：接种在培养皿中培养；
2. 加培养液、MNNG、羟基脲，以及3H-TdR处理等与前5项相同，自5漂洗后；
3. 消化
用0.25 %胰蛋白酶消化、制成悬液；
4. 液闪计数标本制备
10 %三氯醋酸处理，将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上，无水乙醇脱水烤干、置液闪杯中、加闪烁液、置液闪计数仪上计数；结果以dpm/106细胞或cpm/每皿细胞表示。
二、放射自显影法UDS 的测定
1. 细胞培养
WI-38 成纤维细胞，完全培养液支持物盖片培养法培养，细胞生长至汇合时；
WI-38 成纤维细胞，完全培养液支持物盖片培养法培养，细胞生长至汇合时；
2. 抑制DNA 合成
弃旧培养液，加入不含精氨酸的EMEM培养液，继续培养20～24 小时；
3. 加测试物
加入10 mM羟基脲（阳性对照加MNNG），培养2 小时；
4. H-TdR处理
2、3、4 每皿内加3H-TdR（5 μC/每皿）后，培养20～24 小时；
5. 漂洗
去除培养液，用不含钙、镁BSS漂洗；
6. 制片
制备放射自显影标本方法（参考原位杂交基因定位法）固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色；
7. 观察
在油镜下计数，首先要排除S期半保留复制细胞（为银粒密集覆盖的细胞核），只计数核上的银粒数目，再扣除本底（每例计数30～50 个细胞），结果以银粒数/核的均值或含10 个银粒左右细胞的百分率表示。
三、液闪计数法
1. 细胞培养和处理
人二倍体成纤维细胞：接种在培养皿中培养；
2. 加培养液、MNNG、羟基脲，以及3H-TdR处理等与前5项相同，自5漂洗后；
3. 消化
用0.25 %胰蛋白酶消化、制成悬液；
4. 液闪计数标本制备
10 %三氯醋酸处理，将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上，无水乙醇脱水烤干、置液闪杯中、加闪烁液、置液闪计数仪上计数；结果以dpm/106细胞或cpm/每皿细胞表示。
注意事项
1. 本底
与S期DNA合成不同，UDS的量很低，必须将本底控制在相当水平，才能显示UDS。控制本底的关键是减少S期DNA合成；用缺精氨酸的Eagle液培养及羟基脲处理可达到此目的。
做上述处理后也仍有一定量的本底，其来源包括
（1）少数S期细胞的半保留复制；
（2）轻度的微生物污染；
（3）胞浆线粒体的DNA 合成；
（4）自然修复；
（5）3H-TdR非特异性附着；
（6）放射化学杂质；
（7）胸腺嘧啶催化物的重新利用。
（7）胸腺嘧啶催化物的重新利用。
为控制本底，除减少或消除上述因素的影响外，值得注意的是，羟基脲用量过大时也会抑制UDS，并有干扰待检物的作用。因此，应根据不同细胞选择羟基脲的浓度和作用时间，至少使已知阳性致癌物作用能在羟基脲抑制本底水严时显示出来。
2. 药物特性
不同致突变物对细胞作用方式不同，诱导DNA损伤的类型也不用。因此，不同药物的用量及作用时间也不一样。
例如，氮芥在10-4M 时，作用淋巴细胞2 小时就能诱发明显的修复合成，而MNNG引起UDS的高峰却是在作用后的12 小时。
检测不同药物，尤其环境致癌物时，应先作剂量反应曲线，选出最佳显示UDS时间，还要考虑代谢活化作用，避免出现假阴性结果。
3. 细胞
当检测实验细胞的DNA 修复能力。用紫外线照射50 个细胞，结果以银粒数/核的均值或含10 个银粒左右细胞的百分率表示。用二倍体细胞进行实验时，应先做核型分析。
其他
1. 修复DNA 损伤能力；
2. 能代谢活化致癌物；
3. 间期细胞比例大，以及取材方便等性质。
但是，并非每种细胞都具备上述要求条件。
实际上随细胞的不同各有利弊。常用以下几类细胞
1. 原代培养大鼠肝细胞
具有代谢活化致癌物及修复DNA损伤能力，但S期细胞比例大，适合用放射自显影法显示UDS，不宜作液闪计数。
2. 人外周血淋巴细胞
处于静止期细胞多为显示UDS的有利条件，但做致癌物筛选时，存在个体之间的差异问题。
3. 人二倍体成纤维细胞
可用WI-38（ATCCCCL N075），能快速大量增殖，在细胞汇合成单层后，发生接触抑制、细胞停止生长、DNA合成停止；用放射自显影或液闪计数都能获满意的UDS效果，是比较理想的细胞，不足的是不能代谢活化致癌物。
二、结果评价
UDS反映致癌物对细胞的损伤和DNA修复，可用于检测和筛选环境致癌物，有人检测化学物的致癌性，结果证明灵敏度为68%，附合性为69.1%。因此UDS是快速、敏感筛选环境诱变和致癌物方法之一。UDS水平即DNA 修复性计算是以每次实验105细胞中实验组和各对照组掺入3H-TdR dpm 之比。
