实验方法

细胞表面标记的检测技术

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淋巴细胞表面标记主要包括表面受体和表面抗原，淋巴细胞表面标记的检测已广泛用于基础、临床免疫学研究和患者免疫功能的测定。检测方法主要应用同位素、酶和荧光素及其它标记技术。（来源：医学基础免疫学实验指导，主编金伯泉李恩善，第1 版，北京：世界图书出版社，1990）  

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）免疫组化染色技术检测淋巴细胞表面标记

实验原理

APAAP（Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique）技术的基本原理为：抗鼠IgG抗体作为桥梁，将鼠源性识别细胞抗原的第一抗体与鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物相连接，使之成为Ag，-Ab1－Ab2-anti AP-AP的复合物。还可通过二抗将APAAP 复合物重复叠加起来，从而使多个碱性磷酸酶标记于组织细胞上第一抗体所识别的抗原部位，提高了敏感性。

实验材料

APAAP

试剂/试剂盒

TBS 固定液

仪器/耗材

载玻片 制片机 湿盒 显微镜

实验步骤

1.  分离外周血单个核细胞（PBMC），洗涤后用含10 ％FCS PMI1640调整细胞浓度约5×106 /ml
　　　　
2.  自制制片机上制片，充分干燥
　　　　　　　　
3.  用含丙酮-福尔马林固定液中固定30 秒钟
　　　　　　　　　　　　　　　
4.  自来水、蒸馏水依次冲洗
　　　　　　　　　　　　　　　
5.  用TBS稀释特异性McAb或阴性对照抗体（1∶50～500），每片加30～50 μl
　　　　　　　　　　　　　　
6.  室温湿盒孵育30 min，或4 ℃冰箱湿盒中过夜
　　　　　　　　　　　　　　　　
7.  充分用TBS冲洗后，加1∶50羊（兔）抗鼠IgG（GAM或RAM IgG）30～50 μl
　　　　　　　　　　　　　　　　
8.  室温湿盒孵育30 min
　　　　　　　　　　　　　　　　
9.  TBS冲洗后加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（1∶2000）复合物（APAAP）
　　　　　　　　　　　　　　　　
10.  TBS冲洗后可重复叠加GAM或RAM IgG和APAAP2 次，每次孵育10 min
　　　　　　　　　　　　　　　　
11.  冲洗后底物液显色10～15 min
　　　　　　　　　　　　　　　　
12.  自来水冲洗，苏木精衬染，光镜下观察

注意事项

1.  细胞表面抗原的强度以新鲜分离细胞制片、固定为好。若需保存最好干燥密封贮存于-20 ℃低温冰箱中，使用前必须充分干燥后固定。
　　
2.  APAAP中碱性磷酸酶和抗碱性磷酸酶的比例非常重要，抗体浓度过高，易封闭桥抗影响染色结果。
　　
3.  一抗、桥抗和APAAP复合物使用的浓度视细胞表面抗原密度而定，每步洗涤要充分。

 

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