溶血空斑形成试验_实验⽅法

实验原理

溶血空斑形成试验的基本原理是将经绵羊红细胞免疫小鼠的脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围那些受到抗体分子致敏的绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。根据所操作的方法不同可分为直接溶血空斑试验，间接溶血空斑试验，琼脂固相法，小室液相法，单细胞层法等等。

实验材料

血清

试剂/试剂盒

PBS SRBC RPMI1640

仪器/耗材

平皿烧瓶水浴箱华氏管注射器筛网青霉素瓶离心管加样器

实验步骤

1. 底层琼脂平皿的制备

将1.4 ％琼脂加热融化后倾注于平皿内，每个平皿6 ml，凝固后置湿盒37 ℃备用。

2. 0.7 ％琼脂加热融化后加入华氏管内，每管2 ml，47～49 ℃水浴保温备用。

　　
3. 免疫小鼠脾细胞悬液制备

用4×10³个绵羊红细胞（SRBC）盐水悬液腹腔免疫小鼠，对照为等量生理盐水。4 天后，小鼠拉脱颈椎处死，取出脾脏，用RPMI164。洗一次后置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成悬液，洗涤两次，调整细胞数为3～8×10⁶ /ml。台盼兰染色查活细胞数应大于 90％。置4 ℃冰箱备用。

　　
4. 试验平皿的制备

依次将预温40 ℃左右的25 ％SRBC、牼-SRBC吸收的灭活胎牛血清以及保存于4 ℃的脾细胞悬液各0.1 ml加入预热47～49 ℃的含0.7 ％琼脂的华氏管中，迅速混匀，立即倾注于铺有底层琼脂的平皿内，凝固后，置37 ℃孵育1 小时。

5. 加入1∶5～1∶10稀释的新鲜豚鼠血清0.5～1.0 ml，使其均匀覆盖表面，再次置37 ℃温育30 分钟，即可用肉眼或借助于放大镜进行空斑计数。

注意事项

1. 0.7 ％琼脂必须置47～49 ℃水浴融态保温。如温度过高会导致SRBC溶血或所加入脾细胞的死亡。温度过低则在操作过程中琼脂发生凝固，影响上层琼脂平板的制备。

2. 离体的脾细胞应置4 ℃冰箱保存，防止抗体分泌和细胞死亡。

　　
3. 在制备试验平皿时，对于所有玻璃器皿和各种试剂，均需预温，各种试剂加入华氏管后，应与0.7 ％琼脂迅速充分混匀，然后立即倾倒于底层琼脂上，并避免倾入气泡。

　　
4. 加入的补体应均匀覆盖于表层琼脂上。

　　
5. 制备底层平皿和试验平皿时，均须将平皿置于水平台上，以保证琼脂面铺平。

实验方法

溶血空斑形成试验