实验方法

细胞凋亡检测实验

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细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。（来源：免疫学实习指导——北京大学医学部基础医学院免疫学系）


Annexin-V-FITC 单染法

实验原理

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

实验材料

Annexin V-FITC

试剂/试剂盒

标记缓冲液 PBS 去离子水 冰块

仪器/耗材

移液器 吸头 微量离心管 可调速离心机 载玻片 盖玻片 流式细胞仪或荧光显微镜

实验步骤

1.  凋亡细胞的制备

小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg体重，10 h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2×106 /ml，备用。
 
2.  200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm 4 ℃离心10 分钟，弃上清。
 
3.  重复步骤2两次。
 
4.  将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。
 
5.  加入10 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 分钟或4 ℃反应30 分钟。
 
6.  加入300 μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。

注意事项

1.  整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。
 
2.  反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。
 
3.  Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

 

其他

一、实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

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