实验方法

含有目的基因真核表达 pEGFP-C1载体的构建实验

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本实验是以DNA为模板，在4种核苷酸存在的条件下，借助DNA聚合酶作用出现的酶促合成，依赖于在加热条件下，双链DNA解离成单链（变性），降温（复性），使引物与单链特异性结合，同时使4种核苷酸在DNA聚合酶的作用下，发生以引物为起点进行聚合的现象，使DNA链不断延伸，PCR反应进行。内容来源：中国医科大学实验指导手册。

PCR扩增法

实验原理

以DNA为模板，在4种核苷酸存在的条件下，借助DNA聚合酶作用出现的酶促合成，依赖于在加热条件下，双链DNA解离成单链（变性），降温（复性），使引物与单链特异性结合，同时使4种核苷酸在DNA聚合酶的作用下，发生以引物为起点进行聚合的现象，使DNA链不断延伸，PCR反应进行。反应步骤包括：变性（常规采用94℃高温条件下使待扩增的模板DNA氢键断裂，解链成为单链模板）、退火（人工合成的引物在低温下分别与模板DNA单链形成杂交链）、延伸（在72 ℃条件下，DNA聚合酶将单核苷酸在引物3'端掺入，延模板3'→5'方向延伸，合成新的DNA链）。以上三步反应构成一个周期，每一周期产生的DNA均可成为下一个循环的模板，PCR产物以指数方式增加。

实验材料

质粒

试剂/试剂盒

Taq DNA 聚合酶 引物 dNTP混合物 PCR Buffer

仪器/耗材

PCR 扩增仪

实验步骤

1.  按下列组分配制PCR 反应液：
 

                                                                                      共50 μl

2.  PCR 反应条件
 
95 ℃ 5 min
 
95 ℃ 30 sec
 
55 ℃ 30 sec 30 Cycles
 
72 ℃ 1 min
 
72 ℃ 10 min
 
4 ℃ forever

3.  琼脂糖凝胶电泳检测结果

注意事项

PCR 反应液在冰中配制，然后置于PCR 反应仪上进行PCR反应， 这样可增强PCR扩增的特异性， 减少PCR过程中的非特异性反应， 能得到良好的PCR 结果。

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